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ＭＳＣによるヒアルロン酸合成と分解の意義

創傷治癒や組織再生部位ではヒアルロン酸が高濃度で存在することが知られ、その部位では組織幹細胞の移動、増殖、分化が宜進しています。

特に最初のステップとなる幹細胞の移動にヒアルロン酸が影響している可能性は高いです。そこで、ヒアルロン酸がＭＳＣの移動能に与える影響についても検討しました。

ＭＳＣの移動能はボイデンチャンバー法を用いて検討しました。両面をタイプＩコラーゲンで一晩コーティングしたポリカーボネートフィルター(ポアサイズ８μｍ、Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ ｌｎｃ．)で、９６ ｗｅｌｌ Ｂｏｙｄｅｎ'ｓ ｃｈａｍｂｅr （Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ ｌｎｃ．）の各ウェルを上部と下部に分けました。

各種分子量のヒアルロン酸（あるいはヒアルロニダーゼ）をフィルターの下層に入れ、ＭＳＣを含む培地をフィルターの上層に入れました（５×１０４個／ウェル）。各分子量、各濃度のヒアルロン酸当たり４つのウェルを使用して試験しました。

５％ＣＯ２下、３７°Ｃで、チャンバーを６時間インキュベーションした後、下層に遊走・集積したＭＳＣをメタノールにて固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ にて細胞を染色し、６０５ｎｍ で染色された細胞の吸光度を測定しました。

一般的にリガンドとして細胞遊走因子を用いた場合、下層に添加したリガンドの濃度の高い方に細胞が移動する現象をケモクキシスと呼び、上下にリガンドを添加して方向性を持たないランダムな細胞の動きをケモキネシスと呼びます。今回、ヒアルロン酸やヒアルロニダーゼは細胞遊走因子と定義できないため、チャンバーの上層、下層共に何も添加しないＭＳＣの移動量（吸光度）をコントロールとして、下層にヒアルロン酸（あるいはヒアルロニダーゼ）を入れたときに移動したＭＳＣ量を除いたものをケモタキシスインデックスとし、下層にも上層にもヒアルロン酸（あるいはヒアルロニダーゼ）を入れたときに移動したＭＳＣ量を除したものをケモキネシスインデックスとしました。

ＭＳＣはそれ自身が大量のヒアルロン酸を合成しているため、添加したヒアルロン酸の特異的効果を確認するために、ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸のみに特異的に作用する）でＭＳＣの周囲のヒアルロン酸を完全に分解してから実験に供した。この系ではヒアルロニダーゼを除去すると、１〜２時間以内に細胞周囲にヒアルロン酸が蓄積されることを確認しました。

ヒアルロニダーゼを下層あるいは上下層に入れ続けた場合、細胞移動は抑制されました。つまり、ヒアルロン酸が蓄積しない状態ではＭＳＣの移動は抑制され、ＭＳＣの移動にはヒアルロン酸が必要であること が示唆されました。

ｎ＝３のＨＡオリゴ糖はヒアルロン酸レセプターに結合できず、ｎ＝１０以上のＨＡオリゴ糖は結合できるとされています。そこで、ｎ＝１０のＨＡオリゴ糖を、高分子ヒアルロン酸に対する競合阻害剤として用いました。

その結果、ｎ＝１０のＨＡオリゴ糖はケモクキシスインデックスを変化させませんでしたが、ケモキネシスインデックスを低下させました。ケモクキシスインデックスに変化を示さなかったことは、低分子オリゴ糖にはＭＳＣを引きつける効果がないことを、またケモキネシスインデックスを低下させたことは、低分子オリゴ糖が内因性のヒアルロン酸に措抗してＭＳＣの運動性を抑制した結果であると考えられます。

最も高分子である１９０万のヒアルロン酸はケモクキシスインデックスを増加させて、ケモキネシスインデックスを低下させました。このことから、高分子量のヒアルロン酸はＭＳＣを引きつけ、とどめようとする作用があると推察されます。

また、このヒアルロン酸作用は濃度および分子量依存的に強まる傾向かありました。ヒアルロニダーゼ、ＨＡオリゴ糖によるケモキネシスインデックスの減少、高分子量のヒアルロン酸によるケモキネシスインデックスの減少から、ＭＳＣの移動には適切な量の内因性高分子ヒアルロン酸が必要であるということが示唆されました。

以上述べてきたように、ＭＳＣの移動においてヒアルロン酸は分子量と濃度に依存性に影響することが判明しました。またｂＦＧＦ非存在下ではＨＡＳ１が、ｂＦＧＦへの反応性においてはＨＡＳ２による合成変化がＭＳＣのヒアルロン酸合成の重要な要素であることが示唆されました。

組織再生においてＭＳＣが重要な役割を担っていることが認知されようとしている昨今、ＭＳＣによるヒアルロン酸合成と分解の意義が僅かではあるが解明されました。

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