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ＭＳＣのヒアルロン酸合成酵素

ヒアルロン酸含量は合成と分解のバランスによって決定されます。

現在哺乳類でクローニングされ、ヒアルロン酸の合成活性をもつ酵素の遺伝子としてはＨＡＳ１、２、３の３種類が報告されています。

またヒアルロニダーゼ様の遺伝子としては６種類のものが見つかっていますが、実際のヒアルロン酸の分解活性をもつ酵素の遺伝子には精巣由来のＰＨ−２０の他にＨＹＡＬ１、２、３の３種類が報告されています。

今回予備的にヒトＭＳＣのＲＮＡを採取してこれらの遺伝子発現を検討したところ、ＨＡＳ１、２、３とＨＹＡＬ１、２、３のｍＲＮＡが発現していました。

そこで、この６つの遺伝子について特異的Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅとこれを挟む領域の特異的ｐｒｉｍｅｒを設計し、リアルタイムＰＣＲによりこれら遺伝子の絶対定量を行いました。

絶対定量を行うためには、予備的に行ったＰＣＲ産勾をＴ−ｖｅｃｔｏｒへ組み込み、大腸菌を形質転換し、標的遺伝子を大量に含むプラスミドペクターを作製しました。

これらの遺伝子配列を確認後、プラスミドベクターの分子量と濃度から標的遺伝子の標準曲線を作成しました。

遺伝子発現解析にはヒトのものを用いたため、個体差や部位のバラツキを考慮して歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）２種、皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）３種、顎骨由来ＭＳＣ（Ａ−ＭＳＣ）３種、腸骨由来ＭＳＣ（Ｉ−ＭＳＣ）２種を用いました。

Ｉ−ＭＳＣはＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６ポジティブ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５ネガティブで、骨、軟骨、脂肪への分化能が確認されたものをＣＡＭＢＲＥＸ社より購入しました。

Ａ−ＭＳＣは顎骨から骨髄液を採取し、培養皿に付着して増殖してきたものを用いました。

これまでの解析からＡ−ＭＳＣは骨分化能が高いものの、軟骨、脂肪への分化能は低いです。２種類のＩ−ＭＳＣはＡ−ＭＳＣや線維芽細胞に比較して約５倍もＨＡＳ１ｍＲＮＡを発現していました。

ＨＡＳ２、３については細胞問で特徴的な差は認められませんでした。したがって、ＨＡＳ１がＭＳＣの高いヒアルロン酸産生能を規定している一つの要素となっていることが考えられます。

全体的に遺伝子発現の絶対量は合成酵素ではＨＡＳ２＞ＨＡＳ１＞ＨＡＳ３の順に多かったです。

一方ＨＹＡＬに関してはＨＡＹＬ１、２、３ｍＲＮＡ発現にはいずれも細胞問で特徴的な差は認められませんでした。全体的に遺伝子発現の絶対量はＨＹＡＬ２＞ＨＹＡＬ１＞ＨＹＡＬ３の順に多かったです。

特にＨＹＡＬ２の発現はＨＹＡＬ１、３と比較して１０，０００倍以上高かったです。

今回はヒアルロン酸分解酵素のｍＲＮＡ発現を比較したのみで、実際のヒアルロン酸代謝を解明するには酵素活性を考慮にいれた検討も必要です。

またヒアルロン酸の分解にはＨＹＡＬだけでなく、フリーラジカル等の影響も大きいと考えられるため、今回の結果から単純にＨＹＡＬ２がヒアルロン酸分解の中心的役割を果たして いるとは言い切れません。

参考になさってください。

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