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美容に健康に人気のヒアルロン酸。その効果、効能、副作用などの情報を、最新の科学的見地から解説します。中立的なヒアルロン酸比較も掲載しています。

高分子ヒアルロン酸投与による抑制効果

関節リウマチ(RA)においては、インターロイキン1β(IL−1β)や腫瘍壊死因子-α(TNF-α)といった炎症性サイトカインをはじめ、種々の因子が関節破壊の重要なメディエーターとして関与しています。

近年、こうした組織破壊の機序の一つとして軟骨細胞のアポトーシスが注目を集めています。

我々も、再発性多発性軟骨炎(RelapSing poly−chondritis)の病理組織標本を用いた検討で、軟骨細胞脱落のメカニズムとして蛋白分解酵素に よる組織傷害に加え、こうした軟骨細胞自体のアポトーシスの寄与が大きいことを見出しています。

また関節液は軟骨に接し、軟骨に与える影響は大きく、我々もこれまで関節液中の蛋白分解酵素やサイトカインを定量し、骨、軟骨破壊に与える影響を検討してきました。

しかし、関節液全体として軟骨細胞のアポトーシスに及ぼす効果の検討はなされていません。

一方、ヒアルロン酸(HA)は、臨床的に変形性膝関節症(OA)やRA等の治療に用いられますが、その作用機序は完全に解明されたとは言えず、またその軟骨に与える影響を検討した報告は少ないのです。

今回我々は、培養ヒト関節軟骨細胞に及ぼすRA患者関節液の影響を、そのアポトーシス誘導能の点から検討し、またこの系における高分子HAの影響についても検討しました。

1.材料

培養ヒト軟骨細胞は米国Cambrex社より入手した正常ヒト膝関節軟骨細胞(NHAC−kn)を用い、指定された培養液を用いて培養、継代しました。ヒアルロン酸は分子量80万相当、分子量190万相当のHA1%溶液を電気化学工業より分与されました。

2.対象

RA患者6例、OA患者4例で、女性8例、男性2例でした。年齢は38〜74歳(平均59.5歳)、RAではstageV〜W、class2〜3、一例はムチランス型、一例はstage、class不明例でした。

関節液は、滑膜切除術や人工膝関節置換術時に採取した関節液を3000回転で10分間遠心して上清を分取し、−80°Cで保存したものを使用しました。

3.軟骨細胞のアポトーシス誘導

NHAC-knを指定された方法で6−well培養プレートに継代し、Subconfluentに達するまで培養した後、患者関節液を10%の濃度で加えて一晩培養しました。一部実験では、この培養系に高分子HAを添加し、その影響を検討しました。

4.アポトーシス細胞の検出

TUNEL染色のApopTagキット(Chemicon lnternational lnc.)を用いて軟骨細胞のアポトーシスを検出しました。細胞を培養プレ ート中で、1%PFA/PBSにて10分間処理して固定した後、トリプシンで剥し、スライドガラスに塗沫、風乾しました。

キット添付のマニュアルに従い、エタノール:酢酸=2:1溶液で5分間再固定した後、20μg/ml proteinaSeKにて15分間消化反応後、terminal deoxynu-cleotidyl transferase(TdT)によるdigox−igenin−dNTPの添加、およびperoxidaseと3−3 diaminobenzidine tetrahydrochlorideを用いた免疫組織化学で陽性細胞を検出しました。

また別途、2%Hoechst 33342 (Sigma)を培養系に加え、37°C、5%CO2下で30分反応させた後、蛍光顕微鏡にて核の形態を観察しました。

いずれの場合も各サンプルについて約150個の細胞をカウントし、アポトーシス陽性率を算出した。

この結果については次回のコラムでご紹介したいと思います。

参考になさってください。

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管理人からのコメント

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参考にしてみてください。

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